Stran uporablja piškotke

Medicinska fakulteta Univerze v Mariboru

Celice beta med razvojem in remisijo z dieto povzročene sladkorne bolezni
(ARRS: N3-0133)

 

Osnovni podatki projekta

Naslov: Celice beta med razvojem in remisijo z dieto povzročene sladkorne bolezni

Koordinator projekta: prof. dr. Andraž Stožer

Trajanje: 1.1.2019 - 31.12.2022

Obseg FTE 1,23 FTE

 

Klasifikacija ARRS:

Koda: 3.07.00

Veda: Medicina

Področje: Metabolne in hormonske motnje

 

Iz vsebine

Več kot 80 % bolnikov s kratkotrajno SB2 in približno 50 % bolnikov z dolgotrajno SB2 doseže normoglikemijo brez dodatnega zdravljenja (t. j. ozdravitev) po izgubi telesne mase zaradi zelo nizkokalorične diete (VLCD, angl. very-low-calorie diet) in okrog 60 % bolnikov s kratkotrajno ter 20 % bolnikov z dolgotrajno SB2 lahko s pomočjo izokalorične diete vzdržuje normoglikemijo vsaj še 6 mesecev po VLCD. Opisano izboljšanje presnove glukoze spremljajo zmanjšanje vsebnosti maščob v jetrih, izboljšana občutljivost jeter na inzulin in zmanjšanje endogene proizvodnje glukoze, prav tako zmanjšanje vsebnosti maščob v trebušni slinavki in izboljšano delovanje celic beta, ob nespremenjeni periferni občutljivosti na inzulin (v maščobnem in skeletnomišičnem tkivu).

Genetski in prehranski modeli SB2 neustrezno odražajo razvoj SB2 pri človeku in le nekaj raziskav proučuje reverzibilnost okvar celic beta [24, 25]. Patofiziološke raziskave imajo za osnovo modele funkcije celic beta, ki vključujejo razpršene celice beta ali izolirane otočke in večinoma ignorirajo funkcionalno sklopljenost celic beta v večceličnem sinciciju, kljub naraščajočim dokazom, da so medcelične povezave predpogoj za normalno izločanje hormonov in kljub dejstvu, da metodološki pristop z akutno tkivno rezino omogoča študij teh vidikov fiziologije celic beta [26-30].

Razvili in validirali bomo nov, s prehrano povzročenega modela SB2, t. i. miši, hranjenih z zahodnjaško hrano (WD, angl. western diet), ki ima boljšo translacijsko vrednost zaradi dejstva, da je ta hrana bolj primerljiva zahodnjaški prehrani po svoji sestavi in zaradi diete za namene poprave poškodb funkcije celic beta. Funkcijo celic beta v tem modelu bomo študirali z uporabo priprave akutnih tkivnih rezin v povezavi z elektro- in optofiziološkimi metodami kot tudi z analitičnimi metodami grafično-teoretičnega pristopa.

Glavni poudarek bo raziskovanje popravljalnih mehanizmov po kratkotrajnem stradanju z VLCD, ki omogočijo normoglikemijo pri SB2.

 

misi

Slika 1: Metodološki pristop. A Miši C57BL/6J bomo hranili z WD. Po nastopu metabolne motnje bomo del miši izpostavili prehranski intervenciji. B-J Metode uporabljene v projektu. Po pridobitvi tkiv (F) bomo uporabili metodo vpete-krpice membrane (B), optične meritve kalcija in membranskega potenciala (C), počasno sproščanje ujetega kalcija (D), grafično-teoretični pristop (G) in (imuno)histološko barvanje (J). Meritve in vivo bodo vključevale določevanja nivoja glukoze, trigliceridov in holesterola (E), telesne teže (H) in vzorca aktivnosti (I).

 

Raziskovalci

Dolenšek Jurij

Farasin Darja

Gosak Marko

Grgurevič Neža

Kerčmar Jasmina

Križančić Bombek Lidija

Lipovšek Saška

Lukaček Zvezdana

Majdič Gregor

Mlakar Rudi

Pohorec Viljem

Rošer Maruša

Skelin Klemen Maša

Stožer Andraž

Šterk Marko

Šterman Nina

Štrbenc Malan

 

 

Faze projekta in njihova realizacija (maj 2021)

 

gantt

Slika 2: Ganttov diagram vodenja projekta. Delovni paketi (WP). WP0 Teoretično ozadje, načrtovanje poskusov. WP1 Merjenje membranskega potenciala celic beta. WP2 Merjenje [Ca2+]c . WP3 Meritve eksocitoze. WP4 Določanje medcelične povezanosti. WP5 Meritve in vivo. WP6 Histološki in funkcionalni profil v drugih tkivih, merjenje vzorca aktivnosti. WP7 Analiza podatkov in vizualizacija. WP8 Priprava manuskriptov, predstavitve na srečanjih, promocija v medijih. 

 

Cilj 1: Vrednotenje novega mišjega modela debelosti, presnovnega sindroma in sladkorne bolezni tipa 2. 

V delovnem sklopu 5, ki služi realizaciji cilja 1, smo izvedli meritve in vivo na 1. kohorti živali. Skupinsko nastanjene miši linije C57BL6/J smo razdelili v tri skupine, ki so prejemale standardno dieto (CD) ali zahodno dieto (WD) ali WD hrano, ki jo je presekala kratka nizkoenergetska dieta (RCD) in ji sledila CD hrana. Tedensko smo spremljali telesno maso in na dvotedenski ravni še koncentracijo krvnih presnovnih parametrov kot so glukoza, inzulin, trigliceridi in holesterol. 

Da bi našemu modelu dodali uporabno vrednost smo cilj 1 dodatno razširili še na področje vedenjskih študij, saj številne vedenjske raziskave pri laboratorijskih glodavcih kažejo na soodvisnost med uživanjem visokoenergetske hrane in razvojem sprememb v obnašanju. S čustvovanjem povezane duševne motnje so v svetu zelo prevalentne, vendar etiološko (predvsem s prehranskega vidika) manj preučene. Zato smo se v okviru tega projekta odločili s pomočjo standardiziranih testov obnašanja za laboratorijske glodavce preučiti depresivnemu in anksioznemu vedenju podobno obnašanje ter lokomotorično aktivnost v povezavi z razvojem glukozne intolerance in inzulinske rezistence, kar preučujemo vzporedno s preostalimi delovnimi sklopi. 

Rezultati iz tega sklopa so v procesu priprave. 

Cilj 2: Vrednotenje že znanih ugotovitev pri ljudeh na manj heterogenem živalskem modelu, v bolj nadzorovanem laboratorijskem okolju in z biološko posplošitvijo. 

Cilj 2 se v veliki meri prekriva in dopolnjuje s ciljem 1, ki smo ga realizirali v delovnem sklopu 5 in vivo testov (spremembe na ravni celotnega organizma). Cilj 2 pa dopolnjujejo še dognanja in vitro testov na mišjih tkivnih rezinah trebušne slinavke, kakor tudi na humanih tkivnih rezinah oz. otočkih (spremembe na tkivni oz. celični ravni), ki so bila na 1. kohorti živali oz. na humanem tkivu trebušne slinavke uspešno realizirana v preostalih delovnih sklopih (opis teh delovnih sklopov je naveden v sledečih ciljih). Reference so enake kot za cilj 1 in za vse cilje v nadaljevanju. 

 

Cilj 3: Natančnejša določitev disfunkcije celic beta med razvojem sladkorne bolezni tipa 2. 

Realizacijo cilja 3 na 1. kohorti živali pokrivajo delovni sklopi 1-4, 6 in 7. Merili smo membranski potencial, dinamiko [Ca2+]c in ionske tokove v normalnih celicah beta, kakor tudi v človeških celicah in v celicah beta miši na zahodni dieti. Prav tako smo testirali občutljivost eksocitoze na Ca2+ v celicah beta kontrolnih živalih in živalih na WD hrani (1,3,4,9,10). 

Ker naš živalski model dovoljuje tudi študijo funkcionalnega odziva in morfoloških sprememb ostalih tipov celic, smo v sodelovanju s širšo skupino prof. dr. Marka Marhla analizirali tudi spremembe v celicah alfa, katerih pravilno delovanje se je prav tako izkazalo kot ključno pri uspešnejšem vzdrževanju homeostaze glikemije (2,7). 

Cilj 4: Razjasnitev možnosti povratka zgoraj omenjenih sprememb celic beta med remisijo sladkorne bolezni tipa 2. 

Podobno kot pri cilju 3 realizacijo cilja 4 na 1. kohorti živali pokrivajo delovni sklopi 1-4, 6 in 7. Vzporedno na normalnih celicah beta miši na CD hrani in na celicah beta miši na WD hrani smo preučevali tudi celice beta miši, ki so po uživanju WD hrane bile izpostavljene restrikcijski hrani, z namenom preveriti potencialno reverzibilnost nastalih sprememb beta celic zaradi uživanja WD hrane. Tudi v tem primeru smo merili membranski potencial celic beta, dinamiko [Ca2+]c na tkivnih rezinah, merili eksocitozo inzulinskih granul v celicah beta v tkivnih rezinah trebušne slinavke, ocenjevali medcelične sklopitve z elektrofiziološkimi metodami in primerjali kalcijeve signale s pomočjo teorije kompleksnih mrež. 

Rezultati iz tega sklopa so v pripravi. 

Cilj 5: Vrednotenje novih celičnih tarč kot potencialnih terapevtskih sredstev. 

Realizacijo cilja 5 na 1. kohorti živali pokrivajo delovni sklopi 1-4, 6 in 7. Z avtomatiziranim določanjem področij zanimanja (ROI) in oscilacij v vseh realnih časovnih domenah smo izvirno opisali dve potencialno zelo pomembni tarči, in sicer znotrajcelične receptorje na membrani endoplazemskega retikuluma, IP3 receptorje in rianodinske receptorje. Testirali smo specifične farmakološke agoniste in antagoniste in ugotovili, da je aktivacija teh receptorjev zadostna in nujno potrebna za aktivacijo celic beta v fizioloških razmerah. 

Rezultati iz tega sklopa so predstavljeni v članku, ki je v postopku recenzije. 

Cilj 6: Potrditev ali zavrnitev Taylorjeve hipoteze, ki pravi, da je pri posameznih korakih sprememb med razvojem sladkorne bolezni tipa 2 mogoče najti vzporednice pri spremembah, ki se dogajajo med remisijo. 

Cilj 6 je nadgradnja cilja 4 s pripadajočimi delovnimi sklopi. Natančna analiza vseh rezultatov pridobljenih že pri cilju 4, ki so v teku, bodo pokazale potencialne vzporednice pri spremembah med razvojem sladkorne bolezni tipa 2 in njene remisije. 

Rezultati iz tega sklopa še niso bili objavljeni. 

Cilj 7: Prispevati k prepoznavnosti pristopa priprave in dela na akutnih tkivnih rezinah trebušne slinavke tudi v drugih laboratorijih po svetu. 

V delovnem sklopu 8, ki služi realizaciji cilja 7, smo kot prvi v svetu izpopolnili celotno metodologijo priprave in dela na akutnih tkivnih rezinah trebušne slinavke in vsa dognanja predstavili v obliki obsežnega preglednega članka. Šli tudi korak dlje v smislu razvoja tkivnih nadomestkov oz. alternativnih eksperimentalnih sistemov, ki z uporabo modernih tehnik tkivnega inženirstva in aditivne proizvodnje posnemajo strukturo in funkcionalnost tkiv ali organov in vitro (5, 6). 

Cilj 8: Prispevanje k prepoznavanju vloge naprednih računalniških pristopov pri preučevanju celic beta v stanju zdravja in bolezni na živalskih in človeških otočkih trebušne slinavke. 

V delovnem sklopu 7, ki služi realizaciji cilja 8, smo na 1. kohorti živali in humanem tkivu trebušne slinavke s pomočjo teorije kompleksnih mrež ovrednotili rezultate pridobljene pri delovnih sklopih 1 in 2. 

Posnete časovne vrste [Ca2+]c ali membranskega potenciala smo ovrednotili z izračunom različnih mrežnih mer kot so povezanost, gručavost, globalna učinkovitost, prisotnost skupnosti, modularnost in drugo. Na ta način smo lahko sistematično primerjali prostorsko-časovne dinamike [Ca2+]c med otočki miši hranjenih s CD, WD in restrikcijsko prehrano. Vsi izračuni temeljijo na lastno izdelanih algoritmih v programih C++ in Python. 

Rezultate smo doslej predstavili v obliki znanstvenih člankov (3, 4) in prispevkov na konferencah (9, 10). 

 

REFERENCE 

 

[1] PODOBNIK, Boris et al. β-cells operate collectively to help maintain glucose homeostasis. [COBISS.SI-ID 512974648]. 

[2] GRUBELNIK, Vladimir et al. Modelling of dysregulated glucagon secretion in type 2 diabetes by considering mitochondrial alterations in pancreatic α-cells. [COBISS.SI-ID 25073672]. 

[3] ŠTERK, Marko et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. [COBISS.SI-ID 26793987]. 

[4] ZMAZEK, Jan et al. Assessing different temporal scales of calcium dynamics in networks of beta cell populations. [COBISS.SI-ID 56986115]. 

[5] STOŽER, Andraž et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. [COBISS.SI-ID 62209795]. 

[6] MILOJEVIĆ, Marko et al. Modeli in vitro endokrine trebušne slinavke = In vitro models of the endocrine pancreas. [COBISS.SI-ID 55842819]. 

[7] GRUBELNIK, Vladimir et al. Mitochondrial dysfunction in pancreatic alpha and beta cells associated with type 2 diabetes mellitus. [COBISS.SI-ID 43234819]. 

[9] GOSAK, Marko et al. Glucose-dependent intercellular calcium dynamics and functional connectivity in human pancreatic islets from non-diabetic and diabetic donors. [COBISS.SI-ID 36540419]. 

[10] GOSAK,Marko. Examining the collective dynamics and function of pancreatic islets of Langerhans with network science approaches. [COBISS.SI-ID 512967224].