Optimizacija odkrivanja vzročnih mutacij pri diagnosticiranju dednih bolezni s tehnologijo sekvenciranja naslednje generacije

Akronim: OptMutNGS
Trajanje projekta: 4 meseci
Klasius-P-16: 9 - Zdravstvo in socialna varnost

OSNOVNI PODATKI VISOKOŠOLSKEGA ZAVODA
Medicinska Fakulteta, Univerza v Mariboru, Taborska Ulica 8, 2000 Maribor
Telefonska številka: (02)2345854
Elektronski naslov: uros.potocnik@um.si
Zakonit zastopnik visokošolskega zavoda: Prof. dr. Zdravko Kačič, rektor UM

OSNOVNI PODATKI ORGANIZACIJE IZ NEGOSPODARSKEGA ALI NEPROFITNEGA PODROČJA
Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska ulica 5, 2000 Maribor
Zakonit zastopnik: Prof. dr. Vojko Flis, dr. med.
Strokovni sodelavec: Prof. dr. Nataša Marčun Varda, dr. med.

Utemeljitev in cilji projekta
Izum tehnologije sekvenciranje naslednje generacije (ang. NGS za Next generation sequencing) je prinesel revolucijo v diagnosticiranju dednih, predvsem monogenskih bolezni. Do danes je bilo odkritih več kot 7000  monogenskih dednih bolezni, ki nastanejo zaradi podedovane mutacije v  enem samem genu in skupno prizadenejo okrog 2% populacije.  Te bolezni praviloma prizadenejo otroke do 5 leta in so večino izredno hude, mnoge povzročijo smrt že v zgodnjem otroštvu, večina pa doživljensko invalidnost. Odkritje vzročne mutacije je tako edini relevantni pristop za postavitev pravilne diagnoze in pravočasno pravilno zdravljenje. V Univerzitetnem kliničnem centru Maribor vsako leto odkrijejo več kot sto posameznikov, ki so primereni za genetsko testiranje. Glede na to, da NGS tehnologija v UKC MB še ni na razpolago, večino vzorcev najbolj nujnih primerov pošiljajo na genetske analize v tujino, v zadnjem času pa tudi v UKC Ljubljana, kar je povezano z dodatnimi finančnimi stroški, dolgotrajnimi  postopki zaradi oddaljene lokacije in omejitvami samo na najnujnejše primere.
Na Medicinski fakulteti Univerze v Mariboru (MFUM), v Centru za humano genetiko in farmakogenomiko (CHMGF) imamo na razpolago ustrezno znanje in infrastrukturo za NGS tehnologijo in v sodelovanju z UKC MB že izvajamo raziskave za vpeljavo diagnostičnih postopkov na osnovi NGS v klinično prakso v UKC MB, v katero so vključeni predvsem bolniki iz  Mariborske regije, ki se zdravijo v UKC MB. Cilj ŠIPK projekta je, optimizacija postopkov NGS za učinkovitejše odkrivanja vzročne mutacije in diagnosticiranje. Cilj je tudi pridobitev kompetenc študentov MFUM s področja uporabe NGS diagnosticiranja v klinični praksi in študentov FKKT UM in FZV za delo v diagnostičnih laboratorijih.

S tehnologijo NGS pridobimo pri eni sami analizi pri enem samem bolniku ogromno podatkov, ki zahtevajo kompleksno bioinformatsko analizo, da lahko izluščimo pravo vzročno mutacijo in pravo diagnozo.  V prvi fazi analize iz surovih podatkov pridobimo seznam več kot 100 000 variant v genetskem zapisu bolnika. Sledi analiza kakovosti podatkov, po kateri običajno pridobimo nekaj deset tisoč verodostojnih variacij. Za procesiranje podatkov do te faza so že razvita dovolj učinkovita bioinformatska orodja in relativno avtomatizirani protokoli. Največja izziv in največjo porabo časa pa predstavlja razvoj pristopa, s katerim bi z dovolj veliko zanesljivostjo iz nekaj deset tisoč variacij v najkrajšem možnem času in kar se da avtomatizirano ugotovili eno mutacijo, ki je vzročna za nastanek bolezni in na osnovi katere lahko diagnosticiramo bolezen. Cilj predlaganega projekta je primerjati zanesljivosti in časovno učinkovitost standardnega postopka ugotovitve vzročne variante, ki temelji na oceni patogenosti variacije z algoritmi Sift ter PolyPhen2 ter preverjanju najboljših kandidatnih različic na podlagi ročnega pregleda znanstvene literature z bolj avtomatiziranimi bioinformatskimi orodji kot sta Human Phenotype Ontology in Exomiser. Cilj projekta je tudi pridobitev kompetenc študentov za diagnosticiranje dednih bolezni s pomočjo NGS tehnologije, ki vključuje celoten postopek od izbora primernih preiskovancev za genetsko testiranje na osnovi kliničnih opisov, odvzem vzorca in izolacija DNA, izvedba sekvenciranja na NGS aparatu, bioinformatska analiza in priprava diagnostičnega poročila.

Izvedljivost vsebinske zasnove projekta
Za dosego cilja bomo izvedli:

1. Vključitev bolnikov. Najprej na osnovi kliničnih opisov bolnikov izbrali bolnike, ki ustrezajo pogojem za gentsko testiranje. Za bolnike bomo izdelali napotne diagnoze, vključno z določitvijo M10 kode. Nadalje bomo odvzeli vzorec krvi. Ta del bo v celoti potekal v UKCMB (partner 1) pod vodstvom prof. Marčun.

2. Laboratorijska analiza. Izolacija DNA iz krvi. Kontrola kakovosti izolirane DNA. Priprava DNA knjižnice. Izvedba sekvenciranja na aparatu MiSeq. Ta del bo potekal v laboratoriju MFUM, v CHMGF pod vodstvom pedagoških mentorjev.  3. Bioinformatska analiza. Obdelava surovih podatkov sekvenciranja iz pridobljenih iz aparata MiSeq. Izvedba kontrole kakovosti podatkov (vključno števila klastrov, pokritosti, uporaba FastQC in Bw, PicardTools v2.3.0 in algoritma MarkDuplicates). Uporaba programa GATK za izdelavo seznama variaciji. Kontrola kakovosti za potrditev verodostojnosti variacij. Ugotovitve vzročne variante, ki temelji na oceni patogenosti variacije z algoritmi Sift ter PolyPhen2 ter preverjanju najboljših kandidatnih različic na podlagi ročnega pregleda znanstvene literature  ter uporaba bolj avtomatiziranimi bioinformatskimi orodji kot sta Human Phenotype Ontology in Exomiser. Ta del bo potekal na MF pod vodstvom pedagoških mentorjev.

4. Priprava diagnostičnega poročila. Interpretacija variacij in določitev vzročnih variant povezanih z napotno diagnozo. Določitev potencialno patogenih različic v genih, ki so povezani z napotno diagnozo, vendar jih ne moremo z zadostno verjetnostjo opredeliti kot vzročne različice. Določitev patogenih različic v genih, ki niso povezani z napotno diagnozo in druga značilna opažanja. Določitev benignih različicv genih, ki so povezani z napotno diagnozo. Ta del bo potekal tako na MF UM kot v UKCMB (partner 1) pod vodstvom vseh pedagoških mentorjev in strokovnega sodelavca. 5. Laboratorijska potrditev vzročnih mutacij z metoto sekvenciranja po Sangerju in RFLP metodi. Ta del poteka na MF UM pod vodstvom pedagoških mentorjev.

6. Primerjava zanesljivosti in časovne učinkovitosti standardne metode in bioinformatskih orodij za avtomatizirano ugotavljanje vzročne mutacije in postavitve diagnoze. Ta del poteka na MF UM in UKCMB pod vodstvom vseh mentorjev.